电泳仪迁移率异常？3招优化缓冲液pH值与离子强度

作者：六一生物发布时间：2025-05-23 09:22:31 点击：

“跑出来的条带模糊拖尾，迁移距离忽长忽短”——这是许多科研人在电泳实验中遭遇的噩梦。当电泳仪迁移率异常时，实验结果的可重复性直线下降，而问题的根源往往藏在实验中最容易被忽视的环节：缓冲液的pH值与离子强度。这两个参数如同电泳实验的“隐形操控者”，直接影响分子迁移速率、分离分辨率甚至条带形态。本文将拆解缓冲液优化的核心逻辑，提供三套可落地的解决方案。

一、缓冲液如何影响迁移率？先搞懂底层逻辑

1. pH值：决定分子的电荷状态

- 核心原理：

蛋白质、核酸等生物分子的电荷数由所处环境的pH值决定。例如：
- 核酸（DNA/RNA）在碱性缓冲液（如pH 8.0的TAE）中带负电荷，pH降低会减少电荷数，迁移率变慢。
- 蛋白质的等电点（pI）是关键：当缓冲液pH＞pI时，蛋白带负电，pH离pI越远，电荷越多，迁移越快。

- 典型问题：

- pH值偏离理论值，导致分子电荷异常。例如，Tris-Glycine缓冲液pH应为8.3，若配成8.0，蛋白质迁移率可能下降20%。

2. 离子强度：调控电场与热效应

- 简单理解：

离子强度高（缓冲液中盐浓度高），导电能力强，电流大，但产热多，可能导致：

- 凝胶发热变形，分子扩散加剧，条带拖尾；
- 高盐抑制核酸与蛋白的电荷效应，迁移率异常（如DNA在高盐中迁移率下降）。

- 反之：

离子强度低，电流小，迁移慢，甚至无法分离（如缓冲液多次重复使用后盐浓度降低）。

二、3招优化缓冲液，拯救迁移率

第1招：精准调节pH值，匹配分子特性

步骤1：按分子类型选缓冲液

- 核酸电泳：

首选TAE（pH 8.0）或TBE（pH 8.3），适合分离DNA/RNA。
*例外*：回收DNA时用TAE（低离子强度，减少电泳产热）。

- 蛋白质电泳：

SDS-PAGE用Tris-Glycine缓冲液（pH 8.3），等电聚焦电泳用对应pH范围的载体两性电解质。

步骤2：用pH计校准，避免手工误差

- 错误操作：

仅凭pH试纸或经验调pH，误差大（如目标pH 8.3，实际可能7.8-8.8）。

- 正确操作：

1. 配制缓冲液后，用pH计测量（校准后精度±0.01）；
2. 若pH不符，用1M HCl或1M NaOH微调（每次加1滴，混匀后再测）。

案例：pH值拯救蛋白分离

- 问题：跑BSA（pI 4.7）时，用pH 7.0缓冲液，蛋白迁移慢且条带模糊。
- 解决：换用pH 8.3缓冲液，蛋白带负电荷增多，迁移率提升30%，条带清晰锐利。

第2招：控制离子强度，平衡导电与产热

原则1：新配缓冲液，拒绝重复使用

- 重复使用风险：

缓冲液用3次以上，离子消耗+杂质积累，离子强度下降＞50%，迁移率波动可达40%。

- 解决方案：

- 每次实验用新鲜缓冲液，上槽（样品端）用新液，下槽用旧液（可重复1次）。
- 测电导率监控：1×TAE电导率约4-5mS/cm，低于3mS/cm时必须更换。

原则2：根据凝胶浓度调整盐浓度

- 高浓度凝胶（如15% SDS-PAGE）：

离子强度可稍高（如Tris-Glycine缓冲液中Tris浓度提高至0.125M），增强驱动力。

- 低浓度凝胶（如0.8%琼脂糖）：

用低离子强度缓冲液（如1×TAE），减少产热导致的凝胶融化。

案例：离子强度解决核酸拖尾

- 问题：DNA电泳条带拖尾，检测发现缓冲液电导率达15mS/cm（正常4-5mS/cm），盐浓度过高。

- 解决：稀释缓冲液至1×浓度，电导率降至4.8mS/cm，拖尾现象消失。

第3招：添加辅助试剂，优化迁移环境

1. 核酸电泳：加EDTA抑制核酸酶

- 作用：

EDTA螯合镁离子（Mg²+），抑制核酸酶活性，同时不显著影响离子强度。

- 浓度：

TAE和TBE中EDTA默认浓度0.04M，若样品易降解，可提高至0.08M。

2. 蛋白质电泳：用SDS确保电荷均匀

- 关键作用：

SDS（十二烷基硫酸钠）使蛋白质带上均匀负电荷，消除电荷差异，仅按分子量分离。

- 注意事项：

- 溶解SDS时水温需60℃左右，避免结块；
- 电泳过程中保持温度＜25℃，防止SDS析出（低温下溶解度降低）。

3. 通用技巧：用甘油/蔗糖增加样品密度

- 问题场景：

样品密度低，上样时扩散到缓冲液中，迁移率不稳定。

- 解决方法：

在上样缓冲液中添加10%-15%甘油或5%蔗糖，提高密度，使样品沉到孔底。

三、日常维护：避免缓冲液“悄悄变质”

1. 储存方法：

- 固体缓冲试剂密封存放于干燥处，避免吸潮（如Tris粉末受潮后pH值改变）；
- 液体缓冲液分装成小瓶（500mL/瓶），4℃冷藏，避免反复冻融（尤其含SDS的溶液）。

2. 标签管理：

每瓶缓冲液注明配制日期、pH值、浓度，避免误用（如把10×TAE当1×使用）。

四、常见问题Q&A

Q1：缓冲液pH值调过头了，能补救吗？
- A：若pH偏高，用稀盐酸（0.1M）微调；若偏低，用稀氢氧化钠（0.1M）调整。但超过±0.5pH单位时，建议重新配制（误差太大影响实验）。

Q2：离子强度高了，稀释后能用吗？
- A：短期应急可稀释，但需重新测pH值（稀释可能导致pH波动）。长期建议按正确浓度配制，确保离子强度和pH双达标。

Q3：不同品牌的缓冲液试剂混用，影响大吗？
- A：可能有差异！不同品牌的Tris、甘氨酸等纯度不同，建议固定使用同一品牌，避免批次差异导致迁移率不稳定。

积累数据后，可通过线性回归分析找到特定实验体系的最佳缓冲液参数区间。例如某实验室发现，当pH=8.2且离子强度=45 mM时，质粒DNA的超螺旋与线状形态分离度提升22%。

本文由北京六一生物编辑整理。

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