双向电泳仪的实验原理及方法

作者：六一生物发布时间：2024-05-22 08:58:07 点击：

在生物化学和分子生物学研究中，电泳技术是一种常用的分离分析方法。其中，双向电泳是一种重要的实验技术，它可以根据样品中蛋白质的带电性质，将蛋白质按照迁移率的大小进行分离。本文将详细介绍双向电泳仪的实验原理及方法。

一、实验原理

双向电泳（two-dimensional electrophoresis, 2-DE）是等电聚焦电泳（isoelectric focusing, IEF）和SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）的组合。实验分为两个步骤：

等电聚焦：蛋白质根据其所带电荷的性质和电量，在pH梯度胶内（载体两性电解质pH梯度或固相pH梯度）进行分离，直至达到各自的等电点。
SDS-PAGE：在垂直方向上，蛋白质按照其分子量大小进行第二次电泳分离。
经过这两次分离，蛋白质会按照其等电点、分子量和表达量等信息分布在凝胶的相应位置，形成二维分布的蛋白质图。

二、实验方法

样品制备：首先，需要破碎细胞以释放蛋白质，并通过化学法和机械裂解法破碎以尽可能溶解和解聚蛋白。同时，需要去除核酸等非蛋白物质，并添加蛋白酶抑制剂以保持蛋白完整性。

三、等电聚焦：

1、在小管中加入DTT、Bio-Lyte等试剂，与水化上样缓冲液和样品充分混匀。
2、取出IPG预制胶条，室温中放置一段时间后，沿着聚焦盘或水化盘中槽的边缘至左而右线性加入样品。注意在槽两端各1cm左右不要加样，中间的样品液一定要连贯。
3、去除预制IPG胶条上的保护层，分清胶条的正负极，轻轻地将胶条胶面朝下置于聚焦盘或水化盘中样品溶液上。
4、在每根胶条上覆盖矿物油，防止胶条水化过程中液体的蒸发。
5、对好正、负极，盖上盖子进行等电聚焦。

四、SDS-PAGE：

1、将经过等电聚焦的凝胶水平放置在第二个平板状凝胶上，进行SDS-PAGE电泳分离。
2、电泳结束后，通过染色等方法观察电泳图，得到二维分布的蛋白质图。

以上步骤完成后，可以根据实验需要，从凝胶中切取出单个蛋白质点，并通过质谱等方法进行鉴定。

总之，双向电泳仪是一种有效的蛋白质分离和分析工具。通过掌握其实验原理和方法，可以帮助研究人员更准确地了解蛋白质的结构和功能特性。

本文由北京六一生物编辑整理。

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