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行业知识
双向电泳仪的实验原理及方法
作者:六一生物
发布时间:2024-05-22 08:58:07
点击:
在生物化学和分子生物学研究中,电泳技术是一种常用的分离分析方法。其中,双向电泳是一种重要的实验技术,它可以根据样品中蛋白质的带电性质,将蛋白质按照迁移率的大小进行分离。本文将详细介绍双向电泳仪的实验原理及方法。
一、实验原理
双向电泳(two-dimensional electrophoresis, 2-DE)是等电聚焦电泳(isoelectric focusing, IEF)和SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)的组合。实验分为两个步骤:
等电聚焦:蛋白质根据其所带电荷的性质和电量,在pH梯度胶内(载体两性电解质pH梯度或固相pH梯度)进行分离,直至达到各自的等电点。
SDS-PAGE:在垂直方向上,蛋白质按照其分子量大小进行第二次电泳分离。
经过这两次分离,蛋白质会按照其等电点、分子量和表达量等信息分布在凝胶的相应位置,形成二维分布的蛋白质图。
二、实验方法
样品制备:首先,需要破碎细胞以释放蛋白质,并通过化学法和机械裂解法破碎以尽可能溶解和解聚蛋白。同时,需要去除核酸等非蛋白物质,并添加蛋白酶抑制剂以保持蛋白完整性。
三、等电聚焦:
1、在小管中加入DTT、Bio-Lyte等试剂,与水化上样缓冲液和样品充分混匀。
2、取出IPG预制胶条,室温中放置一段时间后,沿着聚焦盘或水化盘中槽的边缘至左而右线性加入样品。注意在槽两端各1cm左右不要加样,中间的样品液一定要连贯。
3、去除预制IPG胶条上的保护层,分清胶条的正负极,轻轻地将胶条胶面朝下置于聚焦盘或水化盘中样品溶液上。
4、在每根胶条上覆盖矿物油,防止胶条水化过程中液体的蒸发。
5、对好正、负极,盖上盖子进行等电聚焦。
四、SDS-PAGE:
1、将经过等电聚焦的凝胶水平放置在第二个平板状凝胶上,进行SDS-PAGE电泳分离。
2、电泳结束后,通过染色等方法观察电泳图,得到二维分布的蛋白质图。
以上步骤完成后,可以根据实验需要,从凝胶中切取出单个蛋白质点,并通过质谱等方法进行鉴定。
总之,双向电泳仪是一种有效的蛋白质分离和分析工具。通过掌握其实验原理和方法,可以帮助研究人员更准确地了解蛋白质的结构和功能特性。
本文由北京六一生物编辑整理。
北京六一生物科技有限公司创建于1970年,50多年的历史,公司先后3次承担电泳装置产品国家、行业标准的起草、修订工作,2009年负责《基础电泳装置》国家标准已发布实施。专业生产生物化学与分子生物学检验分析仪器的科技型国有企业。
主要生产包含电泳仪、紫外分析仪、凝胶成像分析系统、酶标仪、化学发光成像系统、基因扩增仪等检验分析设备。
如果您对我们的产品有任何问题,欢迎您的来电:400 960 6117
我们的目标是:做生物化学分析仪器行业海尔
一、实验原理
双向电泳(two-dimensional electrophoresis, 2-DE)是等电聚焦电泳(isoelectric focusing, IEF)和SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)的组合。实验分为两个步骤:
等电聚焦:蛋白质根据其所带电荷的性质和电量,在pH梯度胶内(载体两性电解质pH梯度或固相pH梯度)进行分离,直至达到各自的等电点。
SDS-PAGE:在垂直方向上,蛋白质按照其分子量大小进行第二次电泳分离。
经过这两次分离,蛋白质会按照其等电点、分子量和表达量等信息分布在凝胶的相应位置,形成二维分布的蛋白质图。
二、实验方法
样品制备:首先,需要破碎细胞以释放蛋白质,并通过化学法和机械裂解法破碎以尽可能溶解和解聚蛋白。同时,需要去除核酸等非蛋白物质,并添加蛋白酶抑制剂以保持蛋白完整性。
三、等电聚焦:
1、在小管中加入DTT、Bio-Lyte等试剂,与水化上样缓冲液和样品充分混匀。
2、取出IPG预制胶条,室温中放置一段时间后,沿着聚焦盘或水化盘中槽的边缘至左而右线性加入样品。注意在槽两端各1cm左右不要加样,中间的样品液一定要连贯。
3、去除预制IPG胶条上的保护层,分清胶条的正负极,轻轻地将胶条胶面朝下置于聚焦盘或水化盘中样品溶液上。
4、在每根胶条上覆盖矿物油,防止胶条水化过程中液体的蒸发。
5、对好正、负极,盖上盖子进行等电聚焦。
四、SDS-PAGE:
1、将经过等电聚焦的凝胶水平放置在第二个平板状凝胶上,进行SDS-PAGE电泳分离。
2、电泳结束后,通过染色等方法观察电泳图,得到二维分布的蛋白质图。
以上步骤完成后,可以根据实验需要,从凝胶中切取出单个蛋白质点,并通过质谱等方法进行鉴定。
总之,双向电泳仪是一种有效的蛋白质分离和分析工具。通过掌握其实验原理和方法,可以帮助研究人员更准确地了解蛋白质的结构和功能特性。
本文由北京六一生物编辑整理。
北京六一生物科技有限公司创建于1970年,50多年的历史,公司先后3次承担电泳装置产品国家、行业标准的起草、修订工作,2009年负责《基础电泳装置》国家标准已发布实施。专业生产生物化学与分子生物学检验分析仪器的科技型国有企业。
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