影响电泳结果的关键因素

作者：六一生物发布时间：2025-06-30 09:20:42 点击：

电泳技术是分子生物学、生物化学和临床诊断等领域不可或缺的核心工具。完美的条带分离、清晰的图谱是实验成功的基础。然而，不理想的结果时常困扰着实验人员：条带模糊、扩散、拖尾、甚至跑不动！问题根源往往在于对关键影响因素的控制不足。理解并精确调控这些变量，是获得可靠、可重复电泳数据的关键。

1.电泳介质的 pH 值:

对蛋白质，氨基酸等类似两性电解质，pH值离等电点越远，粒子所带电荷越多，泳动速度越快，反之越慢。因此，当分离某一种混合物时，应选择一种能扩大各种蛋白质所带电荷量差别的pH值，以利于各种蛋白质的有效分离。为了保证电泳过程中溶液的pH值恒定，必须采用缓冲溶液。

2.缓冲液的离子强度。

溶液的离子强度(lonintensity)是指溶液中各离子的摩尔浓度与离子价数平方的积的总和的1/2。带电颗粒的迁移率与离子强度的平方根成反比。低离子强度时，迁移率快.高离子强度时，迁移率慢，但电泳谱带要比低离子强度时细窄。通常溶液的离子强度在 0.02~0.2之间。

3.电场强度。

电场强度(电势梯度 Electricfield-intensiy)是指每厘米的电位降(电位差或电位梯度)。电场强度对电泳速度起着正比作用，电场强度越高，带电颗粒移动速度越快。"

4.电渗现象。

在电场中液体对于一个固体的固定相相对移动称为电渗。最常遇到的情况是了-球蛋白，由原点向负极移动，这就是电渗作用所引起的倒移现象。产生电渗现象的原因是载体中常含有可电离的基团，如滤纸中含有羟基而带负电荷，与滤纸相接触的水溶液带正电荷，液体便向负极移动。“

(二)凝胶电泳分类

1、琼脂糖。

琼脂糖是一种线性多糖聚合物，是从红色海藻产物琼脂中提取而来的。

2、聚丙烯酰胺凝胶主要有两种方式:

(1)非变性聚丙烯酰胺凝胶(Native-PAGE)。

用于分离和纯化双链 DNA片段的。缺点是DNA的迁移率受碱基组成和序列的影响。无法确定双链 DNA 的大小。是不加入 SDS·和疏基乙醇等变性剂的条件下，对保持活性的蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于酶的鉴定、同工酶分析和提纯。

(2)变性聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)。

用于分离及纯化单链DNA片段，变性DNA的移动速度同其碱基组成及序列几乎完全无关，故可用于分离及纯化单链 DNA 片段和 DNA测序等。SDS是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合形成密度相同的短棒状复合物,不同分子量的蛋白形成的复合物的长度不同，其长度与蛋白质分子量呈正相关。因此，各种蛋白质·SDS复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分子形状的影响，只是分子量的函数。这种电泳方法称为SDS 聚内烯酰胺凝胶电泳(简称SDS-PAGE)。如图。"

(三)DNA凝胶电泳的分辨能力同凝胶的类型和浓度有关。

1、琼脂糖凝胶分辨 DNA 片段的范围为0.2~50kb，凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力也就越强;反之，浓度降低,孔隙就增大，其分辨能力也就随之减弱。2%的琼脂糖凝胶可分辨小到300bp的双链 DNA 分子，而对于较大片段的 DNA，则要用低至0.3%~1.0%6的琼脂凝胶。"聚丙烯酰胺凝胶的分辨能力要高一些，能够分辨较小分子质量的DNA片段，其分辨范围为1~1000bp。20%的聚丙烯酰胺的分辨力可达1~6bpDNA小片段，而要分离1000bp的大 DNA片段，则要用3%的聚丙胺的凝胶。

(四)凝胶电泳的显色

观察凝胶中 DNA的最简便、最常用的方法就是利用荧光染料澳化乙锭进行染色。因此对核酸分子染色之后，将电泳标本放置在紫外光下观察，便可以十分敏感而方便地检测出凝胶介质中DNA的语带部位，在包含有儿种DNA片段的电泳谱带中，每一条带的荧光强度是随着从最大的DNA片段到最小的DNA片段方向逐渐降低的。

(五)影响 DNA凝胶电泳的因素:

琼脂糖主要在 DNA制备电泳中作为一种固体支持基质，其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场中，在中性 pH 值下带负电荷的 DNA 向阳极迁移，其迁移速率由下列多种因素决定:

(1)DNA 的分子大小。

线状双链 DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与 DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中行，因而迁移得越慢。

(2)琼脂糖浓度

一个给定大小的线状 DNA分子，其迁移速度在不同浓度的琼脂凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA 分子的大小。分离小于0.5kb的DNA片段所需胶浓度量 1.2-1.5%，分离大于10kb 的 DNA分子所需胶浓度为 0.3-0.7%，DNA 片段大小间于两者之间则所需胶浓度为 0.8-1.0%。

(3)DNA 分子的构象

DNA分子处于不同构象时，它在电场中移动距离不仅和分子量有关，还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋 DNA在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的，超螺旋 DNA 移动最快，而开环双链 DNA移动最慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条 DNA带难以确定是质粒DNA不同构象引起还是因为含有其他 DNA 引起时，可从琼脂糖凝胶上将 DNA 带逐个回收，用同一种限制性内切酶分别水解，然后电泳，如在凝胶上出现相同的DNA 图诺，则为同一种 DNA。

(4)电源电压

在低电压时，线状 DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量的 DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，片段越大，因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大，因此电压增加，琼脂凝胶的有效分高范围将缩小。要使大于 2kb 的DNA片段有效分高所加电压不得超过5v/cm。

(5)嵌入染料的存在

荧光染料澳化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的 DNA,集料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状 DNA，使其刚性更强，还会使线状 DNA迁移率降低 15%。”

(6)离子强度影响

电泳缓冲液的组成及其离子强度影响 DNA 的电泳迁移率。在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制深胶)，电导率最小，DNA几乎不移动，在高离子强度的缓冲液中(如误加10x电泳缓冲液)，则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化彧 DNA 变性。”

本文由北京六一生物编辑整理。

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