DYCZ-26B双向电泳仪操作全攻略：从入门到精通

作者：六一生物发布时间：2025-07-18 09:17:00 点击：

DYCZ-26B双向电泳仪操作全攻略：从入门到精通

一、样品制备：成功的关键第一步

用DYCZ-26B做双向电泳，样品制备就像盖房子打地基，地基不稳后面再努力也白搭。根据蛋白质来源不同，裂解液的选择大有讲究。我们实验室最常用的是含7M尿素、2M硫脲、4%CHAPS和0.5%IPG buffer的裂解液体系，不管是细胞、组织还是细菌蛋白，这个配方都能高效溶解。

实际操作时，我习惯把蛋白质干粉或提取物加到300μl裂解液里，用超声仪在冰浴下超声溶解30分钟。这里有个小窍门：超声时间别太长，功率也别太高，每次超声5秒停3秒，中间涡旋混匀2-3次，既能充分溶解又不会让蛋白变性。上次有个学生一直连续超声，结果蛋白被打碎了，跑出来的条带全是碎片。

溶解后15000g离心15分钟是必须的步骤，千万别图省事缩短时间。离心后上清要小心翼翼地移到新管里，别把底部的沉淀带起来——那些不溶物要是进了胶条，聚焦时准会出问题。接着用Bradford法测蛋白浓度，这步关键到能决定实验成败。记得做标准曲线时要包含样品 buffer的空白对照，不然CHAPS这类去污剂会干扰检测结果，导致浓度测不准。

特别提醒：DYCZ-26B支持2mm和5mm两种胶条，样品浓度得跟着胶条规格调。我们用2mm细胶条时，蛋白浓度通常调到10-15μg/μl，5mm胶条则降到5-8μg/μl，上样量控制在100-300μg之间效果最好，太多会过载，太少又检测不到低丰度蛋白。

二、等电聚焦：稳定分离的基础

DYCZ-26B的一体化设计把第一向等电聚焦（IEF）操作简化了不少，但细节还是得拿捏好。首先要配水化上样缓冲液，按4:1比例把水化缓冲液（含DTT和Bio-Lyte）和样品混合。我通常用400μl缓冲液加100μl样品，用移液枪反复吹打10次以上，确保混合均匀——千万别用力涡旋，容易产生气泡影响水化。

胶条水化是最容易掉以轻心的步骤。把混合好的样品沿胶条槽底部缓慢加入，避免产生气泡，然后小心放上胶条（胶面朝下），再沿胶条边缘滴加3ml矿物油覆盖。上次有个学生图快，矿物油没铺满，结果胶条边缘干掉了一块，聚焦时直接出现空白区[citation:2]。水化要在20℃条件下静置11-15小时，我们实验室一般晚上开始水化，第二天早上刚好完成，DYCZ-26B的透明槽体能清楚看到胶条慢慢膨胀，膨胀均匀就说明水化充分。

聚焦程序建议用分阶段升压模式，这是保护胶条和仪器的好办法。初始50V低电压聚焦1小时，让样品慢慢进入胶条；接着梯度升到2000V，维持2小时；最后稳定在8000V，总聚焦时间根据胶条长度调整，90mm胶条一般需要6-8小时。DYCZ-26B的智能控制系统能预设这些参数，启动后不用盯着，但最好每2小时看一眼，确保电压电流稳定上升。

聚焦结束后别急着做平衡，先用干净的滤纸片轻轻吸除胶条表面的矿物油和残留液体，动作要轻，别把胶条上的样品蹭掉了。这一步没做好，第二向电泳时容易出现横向条纹。

三、第二向电泳：高效分离的保障

DYCZ-26B的第二向SDS-PAGE不用手动转移胶条，直接在同一设备里完成，这是最省心的设计。操作前要准备好130×100mm的双板凝胶，这是该型号的标准规格，胶浓度根据目标蛋白分子量选，分离小分子蛋白用12%的胶，大分子就用8%。配胶时记得加终浓度0.1%的APS和TEMED，聚合速度快且胶更均匀。

缓冲液总容量约1200ml，我们通常用Tris-甘氨酸-SDS体系，配好后提前半小时倒进槽体，让缓冲液温度平衡到室温。平衡后的胶条直接放在凝胶顶部，注意胶条边缘要和凝胶对齐，然后浇上熔化的0.5%琼脂糖密封（温度别超过65℃，不然会烫坏胶条）。DYCZ-26B的专利密封槽设计特别好用，琼脂糖凝固后完全不会漏胶，解决了以前用其他设备时胶条移位的问题。

电泳参数设置有个小技巧：刚开始用15mA/块胶的电流，等溴酚蓝前沿进入分离胶（大概30分钟），再调到25mA/块胶。这样既能让样品在浓缩胶里充分聚集，又能在分离胶里快速分离。我们实验室跑两块胶时总电流控制在50mA以内，槽体温度用内置冷却系统维持在20℃左右，太高会让蛋白条带扩散。

四、常见问题解决方案

做双向电泳难免遇到问题，分享几个我们实验室总结的实战经验：

- 条带扭曲：第一次做时条带歪歪扭扭，查了半天发现是胶条平衡时间不够。后来把平衡时间延长到2×15分钟（先用含DTT的平衡液，再用含碘乙酰胺的），每次都换新配的缓冲液，条带立马变直了。平衡时要让胶条完全浸没，用镊子轻轻按压排除气泡。

- 横向条纹：出现这种“斑马线”多半是样品没溶解好。试过把超声时间延长到45分钟，中间每10分钟涡旋一次，离心时间也从15分钟加到20分钟，条纹明显减少。另外，裂解液里的尿素容易析出，冬天要用37℃水浴助溶后再用。

- 垂直拖尾：聚焦不充分的典型表现。检查聚焦程序发现，之前直接升到8000V导致聚焦不完全。改成梯度升压后，在8000V维持足够时间（90mm胶条约5小时），拖尾问题基本解决。记得聚焦结束后胶条pH梯度要稳定，可用pH试纸快速检测两端pH值。

- 点状伪影：这些“小黑点”是矿物油残留造成的。现在聚焦后用滤纸片吸干表面时，会沿着胶条轻轻滚动吸干，再用干净滤纸擦一遍槽体，伪影基本消失。另外，矿物油要选电泳专用的，普通矿物油杂质多也会出问题。

五、维护与保养建议

想让DYCZ-26B长期稳定工作，日常维护不能偷懒：

- 每次用完立即用去离子水冲洗槽体，电极上的缓冲盐结晶要用软毛刷轻刷，再用乙醇棉签擦拭——千万别用硬钢丝球，会刮伤电极影响导电性。

- 导线连接处要定期检查，DYCZ-26B的导线柔韧性好，但也要避免过度弯折。我们每季度会拔插一次接口，擦除氧化层，保证接触良好。

- 长期不用时，把槽体擦干后倒置存放，胶条槽里垫张干净滤纸防潮。聚碳酸酯槽体要避免阳光直射，不然会慢慢变黄影响观察。上次暑假没收好，槽体有点发黄，还好不影响使用。

- 电极每月用0.1M稀盐酸擦拭一次，去除表面氧化层，再用去离子水冲净。别小看这点，清洁后的电极导电性更好，聚焦时间能缩短10%左右。

DYCZ-26B双向电泳仪操作不算复杂，但“细节决定成败”这句话在这里特别适用。从样品制备到最后电泳，每个步骤都多留意一点，新手也能做出漂亮的双向电泳图谱。这款仪器设计时充分考虑了国内实验室的需求，把复杂步骤简化的同时没丢精度，确实是蛋白质组学入门的好帮手。

本文由北京六一生物编辑整理。

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