DYCP-36 双向等电聚焦实操指南：核心技术要点解析

作者：六一生物发布时间：2025-10-11 09:08:31 点击：

DYCP-36 双向等电聚焦实操指南：核心技术要点解析

一、凝胶灌注：成败在此一举

双向电泳的第一向（IEF）对凝胶质量的要求堪称苛刻。任何细微的不均都会在第二向中放大。

1、胶液配制：细节决定均一度配制含尿素的两性电解质凝胶时，剧烈的摇晃或搅拌会引入空气并促使尿素降解。我们的经验是使用磁力搅拌器在低速下温和混匀至少15分钟。关键一步：胶液混合后必须进行真空抽滤。这不仅去除了溶解的气体，有效防止聚合后胶体内产生微小气泡，更能滤除未完全溶解的尿素晶体及其他杂质，这是确保凝胶均一性的核心环节。过滤后立即分装并冷冻保存，避免反复冻融。

2、灌注手法：杜绝气泡的秘诀使用玻璃注射器（去除针头）吸取适量胶液。将注射器出口紧密抵近玻璃管底部，以缓慢且恒定的速度推动活塞，使胶液自下而上平稳地填充管内空间。此法利用流体压力自然排出空气，可杜绝传统倾倒法难以避免的气泡问题。灌胶后立即用水封端，确保凝胶界面平整。

二、样品预处理：容易被忽视的关键

样品质量直接决定分辨率，而其离子强度是首要控制指标。

1、电导率管控：高盐是IEF的“天敌” 高盐浓度会引发初始电流过高、聚焦电压无法提升、蛋白修饰乃至烧胶。样品必须经过充分的透析或使用脱盐柱进行处理。条件允许时，可用电导率仪监测处理后的样品，其电导值应接近所用样品水化液的数值。这是一个简单的验证步骤，却能避免多数失败。

2、上样策略：主动水化的优势对于DYCP-36，我们推荐主动水化上样。将样品与水化液充分混合后，直接加入到聚焦槽中，再将预先制备好的IPG胶条（胶面朝下）缓缓放入槽内，确保样品溶液均匀接触胶条全长。此方法比传统杯上样更简便，且能减少样品成团效应，提高重复性。

三、冷却系统：热管理的核心

等电聚焦过程会产生大量焦耳热，有效的热管理是实验成败的关键。

1、冷却液循环：连接是基础，预冷是精髓连接管路时，务必区分“出液口”与“回液口”，并检查所有接口的紧固性，任何泄漏都会导致冷却效率下降。核心技巧：在正式通电前，先开启循环机设定为 18-20℃ 并运行至少15-20分钟，充分预冷电泳槽主体。这一步能为整个聚焦过程建立一个稳定可靠的低温环境，避免初始过热。

2、功率管理：“软启动”的智慧即使冷却正常，初始聚焦阶段也建议采用线性升压或步进式升压。例如，在最初1-2小时内，将电压从低值（如300-500V）逐步升高至最终设定值。这种策略允许体系内的离子先进行初步迁移，避免因瞬间功率过大产生局部过热，从而保护敏感的蛋白质样品并促进稳定pH梯度的形成。

四、聚焦程序：超越时间控制

聚焦程序并非简单设定时间，需根据样品性质进行优化。

以伏小时（Vhr）为完成标准对于复杂样品，仅以时间为控制标准并不精确。更科学的做法是将累积伏小时（Voltage-hours）作为聚焦完成的判断依据。例如，17cm的IPG胶条通常需要60000-80000 Vhr的总量。若仪器支持伏小时控制模式，应优先采用。

梯度聚焦的应用对于难聚焦的样品，可采用步进式升压程序。先在低电压下聚焦一段时间，使样品进入胶内并初步迁移，再阶梯式升高电压至最终值。此策略有助于减轻高盐样品的影响，改善蛋白的聚焦效果。

遵循以上从实践中总结的指南，系统性地把控从制胶到聚焦的每一个技术细节，将极大提升使用DYCP-36进行双向等电聚焦实验的重现性与成功率。精密实验的核心在于对细节的极致追求和流程的标准化控制。

本文由北京六一生物编辑整理。

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