电泳仪使用指南
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电泳仪使用指南
DYCP-40E半干式转印电泳仪实战手册
作者:六一生物
发布时间:2025-07-10 09:30:01
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在实验室待久了,发现Western blot最容易出问题的环节就是转印——条带歪了、背景脏了、甚至蛋白没转过去,这些"翻车"情况我都遇过。好在DYCP-40E这款半干式转印电泳仪帮我解决了不少麻烦。今天就把这几年攒的DYCP-40E半干式转印电泳仪实战经验分享出来,从准备到操作,全是能直接用的干货。
一、开机前的必修课:这些细节比参数更重要
第一次拆开DYCP-40E的包装时,就觉得它长得挺"实在"——270×250×104mm的尺寸,往实验台角落一放,不占地方还稳当。但真正让我觉得"买对了"的是它的碳板电极:以前用金属电极的仪器,稍不注意就生锈,转印时条带总跑偏;这台的碳板用了三年,照样光亮,像个"抗造的铁汉"。
缓冲液配制是第一个不能偷懒的步骤。我一直用Towbin配方(25mM Tris+192mM甘氨酸+20%甲醇),但会根据蛋白特点"量身定制":
- 转小蛋白(比如细胞因子,<20kDa)时,加0.1%SDS,就像给蛋白加了"润滑剂",转得更快;
- 转大蛋白(比如膜蛋白,>100kDa),得把甲醇降到10%——甲醇太多会让大蛋白"卡"在胶里,转不出来;
- 做磷酸化蛋白时,加0.1%EDTA,能减少非特异性结合,背景会干净很多。
滤纸处理有个被很多人忽略的细节:用剪刀把滤纸边缘修成圆角。刚开始我也用直角滤纸,结果转印后边缘总有一圈浓带(就是"边缘效应"),改成圆角后立马好了。另外,拿滤纸一定要用镊子,手上的油脂沾到滤纸上,转印膜会变成"大花脸",血的教训!
二、"三明治"组装:比做蛋糕还精细的活
组装转印"三明治"时,我总结了个"三查三对"原则,像做手术前核对器械一样认真:
1. 查滤纸:6张滤纸都要完全浸透缓冲液,拎起来不滴水、捏着不结块才合格;
2. 查膜:PVDF膜用甲醇激活时,我会定个30秒闹钟——少一秒激活不够,蛋白结合不牢;多一秒膜会变脆,后面洗膜容易破;
3. 查凝胶:跑完电泳的胶要仔细看,有没有缺口、有没有漏样,最好提前用预染Marker确认胶没问题,不然转印也是白费劲。
组装顺序我编了句顺口的口诀:"板纸膜胶纸板"——阳极碳板→3张滤纸→转印膜→凝胶→3张滤纸→阴极碳板。每层放好后,一定要用滚轮像擀饺子皮那样来回滚三遍,力度要均匀,这样才能把气泡赶干净。有次实习生偷懒只滚了一遍,结果膜上一大块没转上蛋白,就是气泡在捣乱。
特别提醒:夏天室温超过25℃时,必须在冰浴里组装!去年夏天我图省事,直接在桌上操作,转出来的膜上全是疙瘩——蛋白受热变性聚集了,只能重做。现在实验室常备冰盒,天热就把整个仪器架在冰上,稳多了。
三、DYCP-40E半干式转印电泳仪参数设置:别给所有蛋白"吃大锅饭"
刚开始用的时候,我不管什么蛋白都按说明书上的"1mA/cm²,30分钟"设置,结果小蛋白跑丢了,大蛋白还没转出来。后来才明白,参数得按蛋白大小"因材施教":
- 小蛋白(<20kDa):1.5mA/cm²,15分钟快转就行。这类蛋白跑得快,时间长了会穿出膜外;
- 中等蛋白(20-100kDa):1.0mA/cm²,30分钟稳转。比如GAPDH、β-actin这些内参,这个参数最保险;
- 大蛋白(>100kDa):得用0.8mA/cm²慢转45分钟,前10分钟还可以降到0.5mA/cm²"预热"——让大蛋白慢慢"动起来",不容易卡胶。
如果样品里蛋白分子量跨度大(比如同时有30kDa和150kDa),我会用"分段转印法":先0.5mA/cm²跑15分钟,让大蛋白挪个窝;再调到1.2mA/cm²跑25分钟,小蛋白也能跟上。就像煮一锅有肉有菜的汤,得先小火炖肉,再中火炒菜,一锅端肯定不行。
四、故障排查:遇到问题别慌,按这几步来
做实验难免出状况,分享几个我常遇到的问题和解决办法:
- 转印不全(胶上还有残留蛋白):
先看残留位置——中间有残留,八成是有气泡;整体都有残留,要么时间不够,要么电流太低。应急办法:①拆开重新组装,重点赶气泡;②缓冲液里加0.1%SDS;③延长15分钟转印时间。
- 背景太脏(膜上一片模糊):
九成是缓冲液放太久(超过3天就别用了),或者电流太高。赶紧换新鲜缓冲液,把电流降到0.8mA/cm²,转完后用TBST狠狠洗3次,每次5分钟,背景能干净不少。
- 出现白斑(膜上一块一块没转上):
对着光看膜,白斑处肯定是有气泡没赶干净。预防比补救更重要:组装时在浅盘里倒点缓冲液,把滤纸、膜、胶都泡在里面操作,气泡根本藏不住。
五、保养秘籍:让仪器多陪你几年
仪器就像战友,你对它好,它才不掉链子。每天实验结束,我必做三件事:
1. 用蒸馏水冲碳板,再用软布擦干——千万别用酒精!碳板怕有机溶剂,会被腐蚀;
2. 检查绝缘垫片有没有裂纹,这玩意儿不贵,但裂了会漏液短路,轻则跳电,重则烧电源;
3. 电源线别乱缠,我会绕成直径10cm的圈,用魔术贴扎好,乱缠容易断芯。
每月还会给它做次"深度SPA":
- 用棉签蘸蒸馏水擦电极接触点,保证通电顺畅;
- 拿张信用卡平刮碳板表面,有刮痕或凸起就该换了(不然电场不均);
- 跑一次标准蛋白Marker做质控,记录转印效果,建立"健康档案"。
现在我桌上的DYCP-40E半干式转印电泳仪已经用了四年,转印效果还和新的一样。其实Western blot不"翻车"的秘诀很简单:细节做到位,仪器保养好,数据自然漂亮。赶紧去检查下你的转印仪吧,说不定它正等着被"呵护"呢!
本文由北京六一生物编辑整理。
北京六一生物科技有限公司创建于1970年,50多年的历史,公司先后3次承担电泳装置产品国家、行业标准的起草、修订工作,2009年负责《基础电泳装置》国家标准已发布实施。专业生产生物化学与分子生物学检验分析仪器的科技型国有企业。
主要生产包含电泳仪、紫外分析仪、凝胶成像分析系统、酶标仪、化学发光成像系统、基因扩增仪等检验分析设备。
如果您对我们的产品有任何问题,欢迎您的来电:400 960 6117
我们的目标是:做生物化学分析仪器行业海尔
一、开机前的必修课:这些细节比参数更重要
第一次拆开DYCP-40E的包装时,就觉得它长得挺"实在"——270×250×104mm的尺寸,往实验台角落一放,不占地方还稳当。但真正让我觉得"买对了"的是它的碳板电极:以前用金属电极的仪器,稍不注意就生锈,转印时条带总跑偏;这台的碳板用了三年,照样光亮,像个"抗造的铁汉"。
缓冲液配制是第一个不能偷懒的步骤。我一直用Towbin配方(25mM Tris+192mM甘氨酸+20%甲醇),但会根据蛋白特点"量身定制":
- 转小蛋白(比如细胞因子,<20kDa)时,加0.1%SDS,就像给蛋白加了"润滑剂",转得更快;
- 转大蛋白(比如膜蛋白,>100kDa),得把甲醇降到10%——甲醇太多会让大蛋白"卡"在胶里,转不出来;
- 做磷酸化蛋白时,加0.1%EDTA,能减少非特异性结合,背景会干净很多。
滤纸处理有个被很多人忽略的细节:用剪刀把滤纸边缘修成圆角。刚开始我也用直角滤纸,结果转印后边缘总有一圈浓带(就是"边缘效应"),改成圆角后立马好了。另外,拿滤纸一定要用镊子,手上的油脂沾到滤纸上,转印膜会变成"大花脸",血的教训!
二、"三明治"组装:比做蛋糕还精细的活
组装转印"三明治"时,我总结了个"三查三对"原则,像做手术前核对器械一样认真:
1. 查滤纸:6张滤纸都要完全浸透缓冲液,拎起来不滴水、捏着不结块才合格;
2. 查膜:PVDF膜用甲醇激活时,我会定个30秒闹钟——少一秒激活不够,蛋白结合不牢;多一秒膜会变脆,后面洗膜容易破;
3. 查凝胶:跑完电泳的胶要仔细看,有没有缺口、有没有漏样,最好提前用预染Marker确认胶没问题,不然转印也是白费劲。
组装顺序我编了句顺口的口诀:"板纸膜胶纸板"——阳极碳板→3张滤纸→转印膜→凝胶→3张滤纸→阴极碳板。每层放好后,一定要用滚轮像擀饺子皮那样来回滚三遍,力度要均匀,这样才能把气泡赶干净。有次实习生偷懒只滚了一遍,结果膜上一大块没转上蛋白,就是气泡在捣乱。
特别提醒:夏天室温超过25℃时,必须在冰浴里组装!去年夏天我图省事,直接在桌上操作,转出来的膜上全是疙瘩——蛋白受热变性聚集了,只能重做。现在实验室常备冰盒,天热就把整个仪器架在冰上,稳多了。
三、DYCP-40E半干式转印电泳仪参数设置:别给所有蛋白"吃大锅饭"
刚开始用的时候,我不管什么蛋白都按说明书上的"1mA/cm²,30分钟"设置,结果小蛋白跑丢了,大蛋白还没转出来。后来才明白,参数得按蛋白大小"因材施教":
- 小蛋白(<20kDa):1.5mA/cm²,15分钟快转就行。这类蛋白跑得快,时间长了会穿出膜外;
- 中等蛋白(20-100kDa):1.0mA/cm²,30分钟稳转。比如GAPDH、β-actin这些内参,这个参数最保险;
- 大蛋白(>100kDa):得用0.8mA/cm²慢转45分钟,前10分钟还可以降到0.5mA/cm²"预热"——让大蛋白慢慢"动起来",不容易卡胶。
如果样品里蛋白分子量跨度大(比如同时有30kDa和150kDa),我会用"分段转印法":先0.5mA/cm²跑15分钟,让大蛋白挪个窝;再调到1.2mA/cm²跑25分钟,小蛋白也能跟上。就像煮一锅有肉有菜的汤,得先小火炖肉,再中火炒菜,一锅端肯定不行。
四、故障排查:遇到问题别慌,按这几步来
做实验难免出状况,分享几个我常遇到的问题和解决办法:
- 转印不全(胶上还有残留蛋白):
先看残留位置——中间有残留,八成是有气泡;整体都有残留,要么时间不够,要么电流太低。应急办法:①拆开重新组装,重点赶气泡;②缓冲液里加0.1%SDS;③延长15分钟转印时间。
- 背景太脏(膜上一片模糊):
九成是缓冲液放太久(超过3天就别用了),或者电流太高。赶紧换新鲜缓冲液,把电流降到0.8mA/cm²,转完后用TBST狠狠洗3次,每次5分钟,背景能干净不少。
- 出现白斑(膜上一块一块没转上):
对着光看膜,白斑处肯定是有气泡没赶干净。预防比补救更重要:组装时在浅盘里倒点缓冲液,把滤纸、膜、胶都泡在里面操作,气泡根本藏不住。
五、保养秘籍:让仪器多陪你几年
仪器就像战友,你对它好,它才不掉链子。每天实验结束,我必做三件事:
1. 用蒸馏水冲碳板,再用软布擦干——千万别用酒精!碳板怕有机溶剂,会被腐蚀;
2. 检查绝缘垫片有没有裂纹,这玩意儿不贵,但裂了会漏液短路,轻则跳电,重则烧电源;
3. 电源线别乱缠,我会绕成直径10cm的圈,用魔术贴扎好,乱缠容易断芯。
每月还会给它做次"深度SPA":
- 用棉签蘸蒸馏水擦电极接触点,保证通电顺畅;
- 拿张信用卡平刮碳板表面,有刮痕或凸起就该换了(不然电场不均);
- 跑一次标准蛋白Marker做质控,记录转印效果,建立"健康档案"。
现在我桌上的DYCP-40E半干式转印电泳仪已经用了四年,转印效果还和新的一样。其实Western blot不"翻车"的秘诀很简单:细节做到位,仪器保养好,数据自然漂亮。赶紧去检查下你的转印仪吧,说不定它正等着被"呵护"呢!
本文由北京六一生物编辑整理。
北京六一生物科技有限公司创建于1970年,50多年的历史,公司先后3次承担电泳装置产品国家、行业标准的起草、修订工作,2009年负责《基础电泳装置》国家标准已发布实施。专业生产生物化学与分子生物学检验分析仪器的科技型国有企业。
主要生产包含电泳仪、紫外分析仪、凝胶成像分析系统、酶标仪、化学发光成像系统、基因扩增仪等检验分析设备。
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