蛋白质印迹法（Western Blot）实验全流程详解

作者：六一生物发布时间：2025-06-19 09:36:18 点击：

在分子生物学、生物化学和免疫遗传学领域，Western Blot就像一把“精准的钥匙”，能帮我们打开细胞内蛋白质表达情况的大门。它的原理说起来不算复杂，简单理解就是利用特异性抗体，给经过凝胶电泳处理的细胞或生物组织样品“画肖像”，通过观察“肖像”的位置和深浅，就能知道特定蛋白质在样品中的表达情况。下面就从实验器材准备到具体步骤，手把手带大家走一遍完整流程。

一、实验器材准备：兵马未动，粮草先行

做Western Blot实验，这些“家伙事儿”缺一不可：

- 主角——待提取蛋白的细胞：细胞的状态直接影响蛋白提取效果，实验前确保细胞生长良好、状态稳定。
- 辅助工具：冰盒就像“小冰箱”，时刻给试剂和样品“降温保鲜”；96孔板是蛋白浓度测定的“小舞台”；细胞刮板用来把细胞从瓶壁或板壁上“请下来”；裂解液是“幕后功臣”，里面的蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂能防止蛋白在提取过程中被“破坏”；PBS则是清洗细胞的“清水”；EP管负责“收纳”样品；酶标仪是测定蛋白浓度的“检测仪”。

二、实验步骤：步步精心，环环相扣

① 实验样品准备：裂解液直接裂解法

1. 预冷准备：把所有试剂和耗材一股脑儿放进冰盒预冷。这一步就像给实验“降降温”，防止蛋白在提取过程中因为温度变化而“变性”，影响后续实验。
2. 清洗细胞：用移液枪把细胞培养瓶或培养板里的培养液吸干净，再用预冷的PBS冲洗两遍，就像给细胞“洗两次澡”，把残留的培养液和杂质都冲走。最后把PBS也吸得干干净净，给后续加裂解液腾出“空间”。
3. 裂解细胞：加入裂解液后，细胞就像被“施了魔法”，细胞膜破裂，蛋白释放出来。用细胞刮板轻轻把细胞刮下来，再把细胞悬液转移到预冷的EP管中，这一步要轻手轻脚，别把细胞弄“受伤”了。
4. 离心取上清：把EP管放进离心机，4℃、14000rpm离心5分钟。这时候，细胞碎片就像“沉底的泥沙”，而我们需要的蛋白则溶解在上清液里。把上清液转移到新的预冷EP管中，标好号，准备测蛋白浓度。

② BCA测蛋白浓度：给蛋白“称体重”

1. 取出蛋白和标准品：从冰箱里把提取好的蛋白和蛋白标准品请出来，放进冰盒。就像把运动员从休息室带到赛场，准备“一决高下”。
2. 稀释蛋白：把融化后的蛋白按1:10的比例稀释（细胞来源的蛋白是这个比例），稀释完后离心混匀，让蛋白“均匀分布”。
3. 配制BCA溶液：按照BCA试剂盒说明书，把A液和B液按比例配好，这就像调配魔法药水，比例对了才能发挥作用。
4. 加样：取出96孔板，按照蛋白标准品、待测蛋白的顺序，每孔加入20μL，就像给每个小孔“分配任务”。
5. 孵育与测定：往每孔中加入A、B混合液200μL，然后把96孔板放在避光处，37℃孵育30min。最后用酶标仪在560nm测OD值，通过这个数值来判断蛋白浓度。
6. 计算浓度：根据蛋白标准品的OD值做标准曲线，再结合待测蛋白的OD值，就能算出待测蛋白的浓度啦。这里要注意，最佳蛋白浓度为3 - 5μg/μL，要是浓度不合适，还得重新调整。

③ 蛋白变性：让蛋白“改头换面”

1. 融化蛋白：从冰箱取出蛋白，放在冰盒里融化，就像让蛋白从“冬眠”中苏醒。
2. 计算与混合：根据蛋白浓度，算出需要加多少蛋白、裂解液和loading buffer，然后把它们混合在一起。这一步就像按配方调配食材，比例准确才能做出“美味佳肴”。
3. 高温处理：把混合好的蛋白放进恒温器，100℃煮10min。高温会让蛋白的空间结构发生变化，变得“老老实实”，方便后续分离。
4. 储存备用：煮好的蛋白先放在室温下降温，然后放进-80℃冰箱储存，就像把“半成品”放进冷冻室，等需要的时候再拿出来用。

④ 制胶：搭建蛋白分离的“赛道”

1. 检查装置：组装好灌胶装置后，往玻璃板之间灌水，检查是否漏水，就像给房子做防水测试。检查完倒扣晾干10min左右。要是出现漏胶，得检查装置是否卡紧、胶条是否老化；要是玻璃板没洗干净，跑出来的胶可能不平，条带也会拖尾，影响结果观察。
2. 选择浓度：按照试剂盒说明书，根据要分离的蛋白大小选合适的分离胶浓度。不同大小的蛋白就像不同身高的运动员，得选不同规格的赛道才能公平比赛。
3. 灌胶等待：长板在内，短板在外，先加入分离胶，再加入1ml水或无水乙醇液封。等30min后把液封倒掉，等胶干了再加入浓缩胶，再等30min，等凝胶完全凝固，赛道就搭建好了。

⑤ 电泳：让蛋白“跑起来”

1. 准备样品：把冰箱里储存的煮好蛋白样品取出来，放在冰盒里融化，然后再次100℃加热5 - 10min，让蛋白“热热身”。
2. 加样：把蛋白Maker和蛋白样品加入SDS - PAGE凝胶中，蛋白Maker就像比赛中的“标杆”，能帮我们判断蛋白的大小。
3. 设置电压：浓缩胶一般用80V，分离胶用100V，在电压的驱动下，蛋白就开始在凝胶这个“赛道”上奔跑啦。

⑥ 转膜：给蛋白“搬家”

1. 组装装置：取出凝胶，切下需要的部分，然后按照滤纸 - 胶 - 膜 - 滤纸的三明治结构组装好转膜装置。这一步就像搭建“搬家通道”，顺序错了蛋白可就搬不过去了。
2. 准备环境：加入预冷电转液，放上冰袋，把装置放在冰盒里，给转膜过程“降降温”，防止蛋白因为温度过高而“受伤”。
3. 开始转膜：接通电源，恒流300mA，转膜时间根据蛋白大小判断，分子越大，需要的时间越长。这里要特别注意转膜装置的组装顺序，还有正负极电源是否正确，要是弄错了，最后可能看不到条带，就像快递送错了地址，东西自然收不到。

⑦ 牛奶封闭：堵住“空白区域”

1. 取出PVDF膜：PVDF膜是蛋白的“新家”，把它从包装里取出来，准备迎接蛋白入住。
2. 封闭处理：把膜放进加好牛奶的孵育盒中，在摇床上缓慢摇动，室温封闭1h。牛奶里的成分就像“填充物”，能把膜上蛋白没有结合的空白区域堵住，防止后续抗体“乱结合”。
3. 漂洗处理：用TBST缓冲液漂洗杂交膜，把残留的封闭液洗去，为接下来的抗体杂交做好准备。常用的封闭剂还有5%脱脂奶粉、3% BSA，大家可以根据实验需求选择。

⑧ 抗体杂交：让抗体与蛋白“配对”

1. 一抗杂交：把一抗加入孵育盒，室温孵育2h，或者4°C过夜。一抗就像“专属钥匙”，能精准识别我们要检测的蛋白，和蛋白“配对”。
2. 洗膜：倒掉一抗溶液（要是一抗比较珍贵，还可以回收重复使用），用TBST洗膜，每遍10min，洗三次，把未结合的一抗都洗掉。
3. 二抗杂交：把二抗加入孵育盒，常温下孵育1h。二抗就像“信号放大器”，和一抗结合后，能让我们更容易检测到蛋白。

⑨ 显影：让蛋白“现身”

1. 洗膜：弃去二抗溶液，用TBST再洗膜3次，每次10min，把残留的二抗洗干净。
2. 加发光液：沥干膜上的水分，把膜放在化学发光成像仪中，均匀加入ECL发光液。发光液就像“聚光灯”，能让和抗体结合的蛋白“发出光芒”。
3. 显影：操作仪器进行发光显影，这时候，蛋白的条带就会出现在成像仪中，我们就能观察蛋白的表达情况了。这里要注意，使用TBST前，确保pH在7.4 - 7.6，ECL发光液一定要均匀覆盖膜表面，不然条带可能会不均匀。

三、注意事项：细节决定成败

1. 回收缓冲液：电泳结束后，电泳槽内的电泳缓冲液可以回收（记得和新缓冲液区分开），合理利用试剂，节省实验成本。
2. 整理器材：把胶板清洗干净擦干，放在胶板架上；电泳槽放回原处，关闭电泳仪；转膜槽用完后及时清洗，晾干后再放回抽屉。就像做完饭后收拾厨房一样，把实验器材整理好，方便下次使用。
3. 清理垃圾：实验后的染液、胶、膜和其他垃圾及时清理，保持实验室整洁，也是保证实验安全的重要一步。
4. 物归原位：实验完成后，所有物品都要回归原位，把实验带来的水渍擦净。养成这个好习惯，下次做实验就能快速找到需要的器材，提高效率。

Western Blot实验步骤多、细节多，但只要咱们每一步都严格按照流程来，注意这些小细节，就能顺利完成实验，得到准确可靠的结果。要是在实验过程中遇到问题，别着急，多总结经验，也欢迎和大家交流，咱们一起攻克难题！

本文由北京六一生物编辑整理。

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