琼脂糖凝胶电泳全解析：原理、步骤与疑难破解指南

作者：六一生物发布时间：2025-06-19 09:37:16 点击：

各位小伙伴，在分子生物学的实验“江湖”里，琼脂糖凝胶电泳可是一门“基础必修课”，就像学武术得先扎好马步一样，掌握它是咱们在实验室“大展身手”的关键！今天就从实验原理、操作步骤、注意事项到疑难问题，掰开了、揉碎了给大家讲明白！

一、实验原理：分子“赛跑”的秘密基地

电泳这事儿，说白了就是利用化合物的“体型”（分子量）和“电量”（带电荷量）不同，在稳定电场里，它们受到的阻力、电场力不一样，“跑”的速度也就有快有慢，咱们就靠这个把不同化合物分开。而琼脂糖凝胶电泳，就是给这场分子“赛跑”搭了个专属“跑道”——用琼脂糖凝胶当介质。

琼脂糖这东西，结构还挺有意思，是D - 和L - 半乳糖残基像搭积木一样，通过α(1→3)和β(1→4)糖苷键交替连起来的线状聚合物。这些链自己会“卷起来”形成螺旋纤维，再聚合成超螺旋结构，直径大概20 - 30nm。最后搭成的琼脂糖凝胶，就像一个超级复杂的“三维迷宫”，里面的通道直径从50nm到200nm以上都有。分子在里面“跑”的时候，既能钻过这些通道，又得“冲破”通道带来的阻力，体型大的、带电少的自然就跑得慢，分离的目的也就达到了。

二、影响DNA迁移效率的“幕后推手”

1、通过凝胶的电流与电压：电压不是越高越好

根据欧姆定律V = IR，咱们常用的电泳缓冲液一般是微碱性（pH 7.8 - 8.0），DNA分子带着负电荷，就像被电场“拽着”往阳极跑。电压比较低的时候，DNA片段跑的速度和电压大小成正比，电压高点，跑得就快点。

但这里有个“陷阱”！电压太高可不是好事儿，电场强度一升高，分子量比较大的DNA片段，速度就不按比例增加了。打个比方，电压就像汽车油门，踩得太猛，大车反而容易“失控”。所以电压太大，琼脂糖凝胶能分离的DNA范围反而变小。要是想把大于2kb的DNA片段分得清清楚楚，电压最好别超过5 - 8V/cm ，不然结果就“糊成一团”了。

2、DNA分子的大小：小个子跑得更快

双链DNA分子在凝胶里“奔跑”，速度和它碱基对数的常用对数成反比。这就好比跑步比赛，大个头的运动员在拥挤的赛道上跑起来磕磕绊绊，大分子DNA也是一样，摩擦阻力大，钻过凝胶小孔的效率低，自然跑得慢；小分子DNA就像灵活的小个子，在“迷宫”里穿梭自如，速度就快多了。

3、琼脂糖浓度：浓度决定“赛道难度”

琼脂糖凝胶是靠氢键和疏水作用聚合成的多孔胶体，DNA分子要在里面的小孔里“游泳”。这些小孔的大小，和琼脂糖浓度直接相关。浓度越高，小孔就越小，DNA分子“钻”起来就越费劲；浓度低，孔大一些，分子跑起来就轻松点。而且DNA电泳迁移率的对数和凝胶浓度之间，是明明白白的线性关系，选对浓度，分离效果才能“拿捏到位”。

4、DNA的构象：不同形状，速度各异

超螺旋环状（I型）、切口环状（II型）和线性（I型）这三种不同构象的DNA，在琼脂糖凝胶里的“跑步速度”完全不一样。就像同样重量的物体，球形的滚动快，扁平的滑动慢。平时做实验，想分清它们，最好在样品里加上未处理的环状DNA和用限制酶切成线状的同一种DNA作为对照，一对比，不同构象的DNA就“原形毕露”了。

5、凝胶和电泳缓冲液中的染料：染料也会“拖后腿”

染料这东西，会“钻进”双链DNA里，让DNA的负电荷变少，变得更僵硬、更长。这就好比给DNA穿上了厚重的“铠甲”，它在凝胶里跑起来，速度差不多会降低15% 。所以加染料的时候，剂量、时机都得把控好，不然会影响咱们判断DNA的真实迁移情况。

6、琼脂糖种类：各有专长的“跑道材质”

市面上常见的琼脂糖有标准琼脂糖和低熔点琼脂糖，还有一种正在研发的，熔点和凝点在两者之间，集合了前两者的优点。就像不同的跑道有不同的材质，塑胶跑道、煤渣跑道跑起来感觉不一样，不同种类的琼脂糖适合分离的DNA也不一样，得根据实验目的仔细挑选。

7、电泳缓冲液：“溶剂”不对，全白忙活

DNA在电泳缓冲液里“游动”，缓冲液的组成和离子强度对它影响巨大。要是缓冲液里离子太少，比如直接用水代替，电导率变得特别低，DNA就像在“泥潭”里，根本跑不动；要是离子强度太高，像错用了10X电泳缓冲液，电导率飙升，电压一加上去，大量产热，凝胶直接熔化，DNA也变性了，整个实验就“泡汤”了。所以选对合适的缓冲液，调好离子强度，是实验成功的关键一步。

后续还可以继续深入讲解实验步骤、注意事项和疑难解答部分，如果需要我接着完善，或者对当前内容有修改意见，随时告诉我！

本文由北京六一生物编辑整理。

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