DYCZ-30C垂直电泳系统的制胶与上样优化策略

作者：六一生物发布时间：2025-12-22 09:15:26 点击：

获得清晰、尖锐的蛋白条带是Western Blot等下游实验成功的基础。本文超越基础操作，深入探讨利用DYCZ-30C系统时，通过精确调控凝胶浓度、优化上样技巧等关键环节，来显著提高SDS-PAGE分辨率的核心策略。

一、分辨率的核心：梯度与均一凝胶的选择

均一胶：适用于分子量范围相对较窄的样品。优化关键在于根据目标蛋白分子量（kDa）选择最佳丙烯酰胺浓度：

高分子量蛋白（>100 kDa）：建议使用 8% 或 10% 的分离胶，便于大分子迁移。
中分子量蛋白（30-100 kDa）：12% 的分离胶是最通用的选择。
低分子量蛋白（<30 kDa）：使用 15% 或更高浓度的分离胶，以提供足够的阻力，防止小蛋白扩散过快。
梯度胶（如8-16%）：适用于分子量分布极广的复杂样本（如全细胞裂解液）。其孔隙从上到下递减，能同时压缩和分离不同大小的蛋白，使条带更锐利。可使用梯度混合器灌制，或购买预制胶。

二、制胶过程的精细控制

1. 促凝剂的新鲜度：TEMED和APS是聚合关键。APS溶液必须每1-2周新鲜配制，4℃避光保存。陈旧的APS是导致凝胶聚合不均、条带模糊的首要元凶。
2. 灌胶技巧：灌分离胶后，用异丁醇压平界面的效果优于无水乙醇，因其更易去除且界面更平整。去除压平液后，务必用滤纸完全吸干残余液体，否则会稀释浓缩胶，导致界面不齐。
3. 插梳与拔梳：插入梳子时应保持一定角度，缓慢插入以避免气泡。拔梳前，用针头或加样枪头吸取电泳缓冲液轻轻冲洗加样孔，可以清除未聚合的丙烯酰胺碎片，确保孔形完美。

三、上样环节的优化艺术

1. 上样量的“黄金法则”：并非越多越好。对于考马斯亮蓝染色，每孔10-20μg总蛋白；对于Western Blot，每孔20-50μg全细胞裂解液，而高丰度蛋白可能仅需1-5μg。建议进行上样量梯度预实验。
2. 上样缓冲液（Loading Buffer）：确保使用 2× 或 5× 的变性缓冲液，并与样品以适当比例混合，使终浓度为1×。煮沸后务必短暂离心再上样。
3. 加样技巧：将枪头尖端置于加样孔底部，缓慢、平稳地推出样品。样品因比重大于缓冲液，会自然沉降在孔底。避免戳破孔底凝胶，也避免将样品推出时产生气泡搅动邻近孔样品。

四、优化案例：改善低分子量蛋白（<15 kDa）的分辨率

问题：小分子量蛋白条带扩散，与前沿染料太近，难以分辨。

解决方案：

1. 凝胶系统：使用 16% 或 18% 的均一分离胶，或 12-20% 的梯度胶。
2. 电泳条件：采用恒压电泳，全程使用较低电压（如 100V），低温下进行（冷室或冰浴），以降低扩散。
3. 上样缓冲液：可在标准上样缓冲液中增加甘油比例至15-20%，帮助样品更紧密地沉积在加样孔底部。

预期结果：经过优化，小分子量蛋白条带将变得更尖锐，且与溴酚蓝的距离拉大，便于识别和后续分析。

文由北京六一生物编辑整理。

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