电泳实验重复性差？全流程优化方案

作者：六一生物发布时间：2025-08-28 09:20:15 点击：

上周组会，我拿着3次同一样本的电泳图尴尬至极：第一次条带清晰，第二次杂带满屏，第三次目的条带跑偏。导师追问：“同样条件，怎么差这么多？”想起前两个月为出可重复结果，我跑了8次电泳、废了半盒凝胶，直到跟着王老师复盘才发现，问题藏在全流程细节里。今天分享这些踩坑经验，帮大家少走弯路。

一、样品预处理：源头没控好，结果必乱

1. 样本储存固定条件，避免降解

最初提完RNA，有时放-20℃有时放4℃，第二次跑就降解出杂带。王老师点醒：“核酸对温度敏感，储存不固定，降解程度不同。”

优化后：

- 核酸30分钟内分装加RNase抑制剂，立马-80℃保存；
- 蛋白加蛋白酶抑制剂，-20℃分装，避免反复冻融（曾冻融3次致蛋白变性，条带变宽）；
- 样本解冻后冰上放置，2小时内用完，剩余丢弃不回冻。

2. 样本稀释精准操作，不凭感觉

曾凭感觉稀释蛋白，第一次0.5μg/μL、第二次0.8μg/μL，条带亮度差一倍。现在每次：

- 用每月校准的移液枪；
- 先算体积（如稀释到0.5μg/μL，写清样本和稀释液用量）；
- 加完吹打10次（曾因没吹打，条带中间亮两边暗）。

二、试剂配制：浓度/批次不统一，结果必偏

1. 试剂浓度严格按标准，不随意调整

第一次配TAE按50×→1×，第二次浓缩液少就估摸着加，后来测电导率才知是0.9×，跑胶速度差20分钟。现在：

- 缓冲液必按比例精准稀释，用移液管量取；
- 凝胶按“质量/体积”称准（如100mL 1%胶称1g琼脂糖，到小数点后两位）；
- 上样缓冲液用同批次，每管加5μL（曾一次加3μL一次加5μL，亮度差大）。

2. 试剂批次不混用，新批次先试跑

换过新批次琼脂糖没试跑，直接用后果条带宽、杂带多。现在：

- 新批次先试跑：同一样本用新旧试剂对比，没问题再批量用；
- 同一实验用同批次试剂（如WB全程用同一批SDS、Tris）。

三、仪器操作：细节不到位，重复性必差

1. 仪器先校准，再开工

曾没校准电极就跑胶，条带偏一侧；校准后立马居中。现在用前必做：

- 调电极：确保与胶槽平行，两侧距离一致；
- 平胶槽：放水平台用水平仪测，不平垫纸片（曾因倾斜，条带跑成斜线）；
- 预热：开机空载5分钟，待电压电流稳定再上胶（曾因没预热，初始电流波动致条带前端模糊）。

2. 操作步骤标准化，不随意改

曾嫌80V慢，中途调90V，结果条带位置差0.8cm。现在贴标准流程在实验台：

- 浓缩胶80V跑20分钟（溴酚蓝进分离胶）；
- 分离胶120V跑40-60分钟（不中途调参数）；
- 上样按“Marker→样本1→样本2→空白”顺序；
- 用计时器控时，到点断电不凭感觉。

四、结果记录：信息不全，出问题难追溯

1. 记录全关键信息，不遗漏

最初只记样本名和时间，出问题查不到原因。现在实验记录本必写：

- 样本：提取时间、储存温度、稀释浓度、是否冻融；
- 试剂：缓冲液浓度、琼脂糖批次、上样缓冲液用量；
- 仪器：电极是否校准、胶槽是否水平、电压电流；
- 结果：条带位置/亮度/杂带，拍图标日期和样本号。

2. 结果对比分析，快速找差异

每次跑胶后，新图与旧图对比：

- 条带偏查仪器（电极/胶槽）；
- 杂带多查样本（冻融/抑制剂）；
- 亮度差查试剂（浓度/上样量）

总结：全流程标准化，重复性自然好

现在我从样本处理到结果记录，每步都按固定标准来：样本储存统一、试剂浓度精准、仪器先校准、操作不改动、记录详细。最近3次同一样本电泳，条带几乎完全一致。其实电泳重复性差，多是细节没做到位。我以前总“差不多就行”，结果反复返工；现在标准化后反而省时间。

本文由北京六一生物编辑整理。

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