DYCZ-26B双向电泳仪实验操作全流程解析

作者：六一生物发布时间：2025-07-18 09:18:49 点击：

DYCZ-26B双向电泳仪实验操作全流程解析

一、样品制备：实验成败的第一道关卡

样品制备就像双向电泳的“地基工程”，这一步没做好，后面的分离再精密也白费功夫。用DYCZ-26B做实验时，我总会根据样品类型调整裂解液配方——处理常规哺乳动物细胞，我常用8M尿素、2M硫脲、4%CHAPS、40mM Tris-base的基础体系，要是样品里蛋白酶活性高，还会加一丢丢蛋白酶抑制剂 cocktail，不然蛋白容易被降解。

实际操作有个“黄金比例”：300μl裂解液配适量样品，冰浴下超声30分钟。超声时我习惯用“脉冲模式”，开5秒停3秒，中间拿出来涡旋2-3次，既能把蛋白打散又不会因过热变性。有次学生图省事一直开着超声，结果跑出来的条带全是碎片，重新做时严格按脉冲模式来，条带立马清晰了。

溶解后15000g离心15分钟是“净化关”，上清必须清澈透明。上次离心后发现有点浑浊，硬着头皮继续做，结果聚焦时胶条里全是小颗粒，最后图谱一团糟。所以离心后要是不清亮，我会再用0.22μm滤膜过滤一遍，虽然麻烦但能保证后续效果。

测浓度用Bradford法最方便，但要记得做空白对照——把不含蛋白的裂解液也测一下，不然CHAPS会让结果偏高。DYCZ-26B支持2mm和5mm两种胶条，上样量得跟着变：2mm细胶条娇气，50-100μg刚好；5mm胶条能多装些，100-200μg没问题。

二、等电聚焦：精密分离的开端

DYCZ-26B的一体化设计把等电聚焦操作简化了不少，但细节还是得抠。配水化上样缓冲液时，我会按配方精确称量：7M尿素、2M硫脲、4%CHAPS、0.5%IPG buffer加65mM DTT，这些成分缺一不可。混合样品时要轻柔吹打，千万别涡旋出气泡，不然聚焦时蛋白跑不匀。

加样品有个“线性技巧”：沿水化盘槽边缘从左到右慢慢倒，两端各留1cm空着，中间液体要连成片没气泡。有次加样太快，中间裹进个气泡，最后图谱对应位置就缺了一块蛋白点。

胶条处理像“伺候娇气的宝宝”。从-20℃冰箱拿出来的IPG胶条，得在室温放10分钟回温，不然突然遇热会变形。撕保护层时要捏着酸性端（通常标着“+”），碱性端特别脆，上次有个学生用力过猛把碱性端撕裂了，聚焦时直接鼓包。胶条胶面朝下放样品液里时，要用镊子轻轻压一压，让它和液体贴紧实，没气泡才算到位。

盖3ml矿物油时要沿槽边慢慢倒，别冲得样品液乱跑。20℃水化12-16小时正合适，我们一般晚上8点开始，第二天早上刚好。DYCZ-26B的透明槽体特方便，能看到胶条慢慢膨胀变胖，膨胀均匀就说明水化好了。

聚焦程序我偏爱梯度升压：先30V低电压让样品“慢慢走”1小时，再200V、500V、1000V各1小时“加速”，最后8000V“冲刺”到总伏小时达标。记得别预聚焦，IPG胶条电导低，预聚焦会把样品挡在外面进不去胶条。

三、胶条平衡：承前启后的关键步骤

胶条平衡是连接两向电泳的“桥梁”，这步没做好，第二向跑出来的条带准会歪。DYCZ-26B配的专用平衡盘特别好用，槽深刚好能没过胶条。平衡缓冲液配方得记牢：6M尿素、30%甘油、2%SDS、50mM Tris-HCl(pH8.8)，第一步加1%DTT还原，第二步换2.5%碘乙酰胺烷基化。

配制缓冲液有个“保鲜窍门”：DTT容易氧化失效，每次用多少配多少，配好马上用；碘乙酰胺见光易分解，要避光保存。平衡时胶条要完全泡在缓冲液里，用镊子轻轻按几下排掉气泡，每次平衡15分钟，时间别超，不然蛋白会从胶条里跑出来。

平衡前一定要用滤纸片轻轻吸掉胶条表面的矿物油，动作像擦眼镜一样轻柔，别把胶条上的蛋白蹭掉了。有次没吸干净，平衡后胶条表面滑溜溜的，第二向跑出来全是油斑[citation:1]。DYCZ-26B的平衡盘设计得浅，吸油和转移都方便，比以前用的深盘省事儿多了。

四、第二向电泳：高效分离的实现

第二向SDS-PAGE是DYCZ-26B的“拿手好戏”，不用手动移胶条，直接在同一设备里完成，省了好多麻烦。预制凝胶得按标准规格来：130×100mm双板，我们实验室常用10%浓度的胶，分离大多数蛋白都够用。配胶时APS和TEMED要最后加，倒胶速度要稳，别裹进气泡，凝固后胶面要平平整整的。

缓冲液用Tris-甘氨酸-SDS体系，总容量约1200ml，配好后提前半小时倒进槽体，让温度平衡到室温。把平衡好的胶条放到凝胶顶部时，要对齐胶条边缘和凝胶边缘，用镊子轻轻推到中间位置，别歪到一边。

琼脂糖密封是“最后防线”：0.5%琼脂糖煮熔后放凉到65℃左右再用，温度太高会烫坏胶条，太低又容易凝固。浇琼脂糖时沿胶条边缘慢慢倒，让它填满胶条和凝胶之间的缝隙，DYCZ-26B的专利密封槽特别给力，琼脂糖凝固后严丝合缝，从没漏过胶。

电泳参数按“阶梯式”设置：开始用15mA/块胶，等溴酚蓝跑到浓缩胶和分离胶交界处（大概30分钟），调到25mA/块胶。跑两块胶总电流别超50mA，槽体温度靠内置冷却系统维持在20℃左右，夏天室温高时，我会在槽外裹个冰袋辅助降温。DYCZ-26B的开盖断电功能很贴心，有次中途想看看胶的状态，一开盖电源就断了，避免了触电风险。

五、染色分析与问题排查

电泳结束后，考马斯亮蓝染色最常用，步骤简单：固定液泡30分钟，染色液泡1小时，再用脱色液换3次脱色，条带就清晰了。银染灵敏度高但步骤多，适合检测低丰度蛋白。DYCZ-26B跑出来的胶背景干净，蛋白点又圆又清晰，用成像系统拍出来的图特别好看。

实验中遇到问题别慌，分享几个我们的排查经验：

- 水平条纹：第一次出现时以为是胶没配好，换了新胶还是有，最后发现是样品超声时间不够，蛋白没溶透。延长超声到45分钟，中间多涡旋几次，条纹就没了。要是聚焦总伏小时不够也会这样，得保证8000V维持足够时间。

- 垂直拖尾：多半是平衡没做好。有次平衡液里忘了加SDS，跑出来的条带全拖着长尾巴，重新配含SDS的缓冲液，严格两步平衡后，拖尾立马消失。另外电泳缓冲液pH值不对也会这样，每次配完都要测pH，保证在8.3左右。

- 蛋白点模糊：夏天最容易出现，温度太高让蛋白扩散了。虽然DYCZ-26B缓冲液容量大散热好，但室温超30℃时，还是得接循环水冷却，温度控制在20℃左右，蛋白点立马变清晰。

六、设备维护与操作技巧

想让DYCZ-26B双向电泳仪一直好用，日常维护不能懒。每次用完我都按这个顺序清洁：先倒空缓冲液，用去离子水冲槽体3遍，电极上的盐渍用软毛刷轻刷，再用乙醇棉签擦一遍，最后用蒸馏水洗干净。千万别用钢丝球或硬毛刷，会把电极刮花，影响导电性。

导线连接处要常检查，DYCZ-26B的导线柔韧性好，但别使劲弯折接口处。我们每季度会拔下来一次，用干布擦除接口的氧化层，保证接触良好。电极每月用0.1M稀盐酸擦一次，去除表面氧化膜，擦完用清水冲净，导电性会更好。

长期不用时存放有讲究：槽体擦干后倒置在通风处晾一天，胶条槽里垫张干净滤纸防潮，然后放进专用箱子里，别让阳光直射——聚碳酸酯槽体晒久了会变黄，虽然不影响使用，但看着不舒服。平衡盘和盖子单独放在格子里，别压重物，防止变形。

最后分享个“老司机技巧”：每次实验前花5分钟检查设备状态，看看电极是否完好，槽体有没有裂缝，导线有没有破损，提前发现问题能避免实验做到一半出状况。DYCZ-26B操作不算难，但“细节决定成败”，按这套流程来，新手也能做出漂亮的双向电泳图谱。

本文由北京六一生物编辑整理。

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